Что может биотехнология?

Дмитрий СКЛАДНЕВ

Мораторий Берга

Летом 1973 г. Р. Поллак, сотрудник Дж. Уотсона, который к тому времени уже возглавлял лабораторию в Колд-Спринг-Харборе, позвонил Полу Бергу в Стэнфордский университет, что неподалеку от Сан-Франциско в Калифорнии. Незадолго до этого звонка Поллак узнал, что Берг разрабатывает планы введения генов ракового вируса СВ-40 в кишечную палочку с помощью ее плазмиды. В ходе эксперимента планировалось клонировать раковые гены. Это было необходимо для того, чтобы иметь возможность изучать эти гены с помощью методов молекулярной биологии.

Здесь необходимо сделать остановку, чтобы разъяснить значение некоторых слов, иначе будет непонятен дальнейший рассказ. Итак, раковый вирус СВ-40. Он был выделен у обезьян и хорошо трансформировал их клетки в культуре ткани.

Культурой ткани называется способ выращивания клеток в стеклянных чашках и пробирках. Этот метод был создан французом А. Каррелем, который долгое время работал в Америке. В 1912 г. Каррель был удостоен за свое открытие Нобелевской премии по медицине.

Но метод культуры не мог получить широкого распространения до появления антибиотиков, которые предотвращали развитие болезнетворных микроорганизмов. Как удавалось Каррелю в конце XIX и начале, XX в. – когда об антибиотиках никто и не слышал – поддерживать свои культуры, до сих пор остается загадкой. А ведь некоторые культуры он сохранял по тридцать лет!

Культуры хороши тем, что в них легко размножается вирус, который не. живет вне клетки. В институте Солка Р. Дальбекко научился с помощью СВ-40 трансформировать клетки, то есть делать их раковыми, тем самым подтвердив вирусную теорию рака. Как известно, первый раковый вирус был открыт еще в 1908 г. двумя французами – О. Бангом и В. Эллерманом, однако главное открытие в этой области принадлежит американцу П. Роусу, который в 1911 г. писал в своей статье о «фильтрующемся агенте», вызывающем саркому у кур. Со временем этот вирус получил название «вирус саркомы Роуса» (ВСР) и за его открытие Роус в 1966 г. – через 55 лет – был удостоен Нобелевской премии.

Почему это так произошло – тема другого рассказа, сейчас же скажем, что наука о раковых вирусах сделала огромный скачок после войны, когда антибиотики позволили широко распространить по лабораториям метод культуры тканей.

В 50-е годы в дебрях Африки работал английский врач Л. Беркит. Там он столкнулся с интересной формой рака лимфатических узлов у детей. В 1961 г. он, будучи уже в Англии, читал курс лекций в Школе тропической медицины, одну из которых посетил М. Эпштейн. В это время все только и говорили о раковых, или онкогенных, вирусах, поэтому Эпштейн заподозрил наличие вируса и в случае Беркита. Он поехал в Кампалу к Беркиту, где сумел выделить вирус из крови больных, а затем и увидеть его под электронным микроскопом. Сообщение об этом появилось в печати в 1964 г. Так был открыт первый раковый вирус человека. Эпштейну помогала его сотрудница И. Барр, поэтому вирус был назван «вирус Эпштейна-Барр» (ЭБВ).

ЭБВ оказался очень интересным: в Африке он вызывает – если это действительно так – лимфому Беркита, в Юго-Восточной Азии – опухоль в носоглотке. Поэтому ЭБВ так и считали одним из раковых. Но вот в Филадельфии случайно выяснилось, что у представителей белой расы этот вирус вызывает инфекционный мононуклеоз, похожий по своим симптомам на гепатит, то есть воспаление печени.

И СВ-40 и ЭБВ относятся к так называемым ДНК-содержащим вирусам (бактериофаги тоже). Но многие раковые вирусы, например тот же ВСР, вместо ДНК имеют РНК. Эти РНК-содержащие раковые вирусы представляли собой неразрешимую биологическую загадку: каким образом они могли «встраивать» свои гены в геном клетки-хозяина (геномом, напомним, называется совокупность генов). В то время было известно, что на ДНК синтезируется и-РНК, а на ней, уже синтезируется белок. Для нормального развития вируса он должен сначала «встроить» свои гены между клеточными, и только после этого размножаться.

Р. Дальбекко доказал, что в трансформированных, или переродившихся злокачественных клетках имеется специфическая вирусная ДНК СВ-40. Выяснилось также, что СВ-40 имеет всего три гена, два из которых отвечают за синтез белков оболочки. Забегая несколько вперед скажем, что третий ген, или Т-ген (от греческого слова «тумор» – опухоль), вызывает перерождение клеток.

В 1969 г, журнал «Нейчер» в номере от 22 ноября сообщил потрясающую весть о выделении первого гена у кишечной палочки. Фотографии этого гена обошли тогда весь мир. Это было сделано в лаборатории Дж. Беквита в Гарварде. Открылась реальная возможность прямого манипулирования генами. Еще менее чем через десять лет это привело к рождению современной биотехнологии!

Но самое главное открытие ждало мир через полгода. Чтобы понять его значение, необходимо вернуться ненадолго в год 1939-й. Тогда в «Докладах Академии наук» появилась статья.33-летнего ученого С.М. Гершензона, которая называлась «Вызывание направленных мутаций у дрозофилы». В статье излагались результаты скармливания личинкам мушек «тимусной» нуклеиновой кислоты (ДНК) теленка, в результате чего получали наследуемые изменения крылышек насекомых. Так за пять лет до Эйвери, Маккарти и Маклеода была доказана возможность чужеродной ДНК влиять на наследственные признаки организма. К сожалению, началась война, и мы утеряли свой приоритет в этой области.

Значительно позже, уже в 1960 г., Гершензон вернулся к этой проблеме, но решил модифицировать опыт. Среди вирусов, поражающих гусениц бабочек, известен так называемый «вирус ядерного полиэдроза» (ВЯП), который под электронным микроскопом похож на «полиэдр», или многогранник.

Так вот, Гершензон заразил гусениц не молекулой ДНК вируса, а его РНК, выделенной из клеток, пораженных ВЯП. И получил прекрасные вирусные частицы, свидетельствовавшие о том, что информация могла считываться не только с ДНК для синтеза РНК, но и наоборот! Это было непостижимо, ведь все знали, что генетическая информация идет только в одном направлении, как же она может идти в обратном!

Но если факты свидетельствуют об обратном, тем хуже для фактов! Тем не менее похоже, что идея уже витала в воздухе. Несколько позже к ней пришел Г. Темин из Висконсинского университета (там работал Бидл). Ему тоже никто не верил, но он упорно – десять лет – работал над выделением фермента, работающего в «обратном» направлении. И вот в мае 1970 г. на Международном противораковом конгрессе в Хьюстоне он сообщил о победе! В том же мае на симпозиуме по количественной биологии в Кодд-Спринг-Харборе с подобным сообщением выступил Д. Балтимор из Массачусетского технологического института (Бостон). Новый фермент получил название «обратная», или «реверсивная», транскриптаза (РТ), поскольку осуществляет синтез нуклеиновой кислоты как бы в обратном направлении. Советский академик В.А. Энгельгардт предложил называть РТ «ревертазой», что пришлось всем по вкусу. А академик А.А. Баев назвал новый метод синтеза «путь вперед, шагая в обратном направлении».

В 1970 г. журнал «Нью Сайентист», издающийся в Лондоне, поместил в номере от 25 июня репортаж «Центральная догма биологии перевернута вверх ногами». Имелось в виду, что Темин и Балтимор повернули вспять привычный ход, мыслей биологов – в очередной раз! Первый раз это сделали за чуть более пятнадцать лет до этого Уотсон и. Крик, и вот опять. Появился даже термин «теминизм», с чем был решительно не согласен Гершензон, написавший в редакцию журнала «Нью Сайентист»: «Сэр, я вполне согласен с автором статьи в том, что факт способности РНК быть матрицей для синтеза ДНК очень важен для молекулярной биологии и должен привести к практическим результатам. Однако я хотел бы заметить, что термин «теминизм» вводит в заблуждение. В действительности же образование ДНК на матрице РНК было открыто в нашей лаборатории в 1960 г., и первые результаты этой работы были опубликованы за несколько лет до появления первой статьи д-ра Темина по этому предмету. С тех пор мы подтвердили в широких опытах это явление. Я прилагаю оттиск одной из наших первых статей и список наших статей по этому вопросу.

Искренне Ваш, профессор Гершензон С.»

Письмо профессора было опубликовано журналом, поскольку никто не мог спорить с нашим приоритетом в данной области. Но хотелось бы сделать и одно небольшое пояснение.

Ажиотаж вокруг результатов Темина и Балтимора, которым всего через пять лет вместе с Р. Дульбекко вручили Нобелевскую премию, возник не только потому, что они открыли, или повторили открытие нового биологического явления, а потону, что они выделили новый фермент, чего в лаборатории Гершензона не было сделано, потому что не было такой совершенной техники анализа. Все преимущество американских исследователей сегодня перед миром как раз и заключается в этом техническом совершенстве, превосходном лабораторном оборудовании, которое создают и разрабатывают многочисленные первоклассные фирмы. Ведь тому же Темину тоже десять лет никто не верил, пока он не представил на всеобщее обозрение наработанный им фермент. Фермент, который сделал возможным звонок Поллака Бергу.

С помощью РТ стало легко выделять и нарабатывать отдельные гены. Для этого больше не надо было искать определенный участок ДНК, «вырезать» его с помощью специальных ферментов и т.д. Все стало проще и «наоборот». Необходимо было просто стимулировать ген к работе, в результате чего он нарабатывал большие количества и-РНКовых копий, которые относительно легко выделяются из клетки. А потом с помощью РТ можно было сделать копию гена в виде ДНК. Чтобы не путать эту сделанную человеком ДНКовую копию с обычным геном клеточной ДНК, «копийный» ген стали обозначать кДНК.

Теперь скажем два слова относительно «плазмиды». Плазмиды представляют собой крохотные ДНКовые колечки, которые могут «размыкаться», ферментами, встраивать новый ген и переносить его от клетки к клетке. Впервые с плазмидами ученые столкнулись, когда у микроорганизмов была выявлена устойчивость (резистентность) к антибиотикам. Оказалось, что бактериальные плазмиды несут гены, кодирующие синтез белка, разрушающего молекулу антибиотика. Плазмиды свободно плавают в цитоплазме кишечной палочки, перенося между клетками этого микроорганизма, живущего у нас в толстом кишечнике, «оперативную» генетическую информацию. Ген при необходимости можно также «включить» в геном вируса, который, заражая клетку, размножится в ней и даст много копий «необходимого нам гена. Собрав эти копии, мы можем «прочитать» ген, то есть расшифровать последовательность нуклеотидов.

Этот процесс получения копий назвали «клонированном». Слово «клон» в родстве со старым шотландским «клан». Так жители суровой Шотландии называли двенадцать родов – Макинтоши, Макговерны, Макклинтоки и т.д., которые вели борьбу не на жизнь, а на смерть за свою независимость от англичан.

Сегодня процесс чтения генов пока невозможно представить себе без их клонирования. Обычно это делается следующим образом: ген «нарезается» специальными ферментами на кусочки по 300...400 нуклеотидов, после чего они встраиваются в геном фагов. Таким образом. создается «фаговая библиотека», позволяющая наработать достаточное количество генетического материала. Обычно размножение фагов осуществляется в кишечной палочке – «рабочей лошадке» современной биотехнологии. Последнее время это стало возможно делать и с помощью клеток млекопитающих в культуре, но это гораздо дороже, потому что кишечная палочка весьма неприхотливый организм. Ее потребности не сравнить с «запросами» высокоорганизованных клеток млекопитающих. Но. кишечная палочка имеет свой недостаток – с ней бывает трудно получить достаточно полноценный по своим функциям человеческий белок.

И последнее, чтобы можно было дальше продолжать наш рассказ о моратории Берга. Мы уже неоднократно говорили: «разрезать» ДНК, «встроить» ген и т.д. А что все это значит?

В 1959 г. Нобелевскую премию получили С. Очоа и А. Корнберг из Стэнфордского университета. Им удалось впервые выделить особые белки, которые могут «сшивать» или «склеивать» нуклеотиды в полимерные цепочки, синтезируя тем самым макромолекулы ДНК.

Один из таких ферментов был выделен из кишечной палочки и назван ДНК-полимераза. ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК. Обратная транскриптаза тоже относится к классу ДНК-полимераз, только синтез при этом осуществляется на матрице РНК. Таким образом ученые получили в свое распоряжение ферменты, сшивающие и полимеризующие ДНК.

Рис. 3. Схема выделения и клонирования гена в клетках кишечной палочки
а) «Вырезание» гена из двуцепочной ДНК; б) «Разрезание» плазмиды и включение в нее чужеродного гена; в) Введение плазмиды с чужим геном в клетку; г) Клонирование гена в делящихся клетках микроорганизма

Однако что делать, если необходимо двуцепочечную спираль ДНК в клетках «разрезать»? Или, например, в случае мутации, приводящей к появлению неправильной «буквы» в генетическом тексте, эту букву вырезать и заменить на нормальную? В этом помогают ферменты-«рестриктазы», разрезающие цепь ДНК в строго определенном месте (название рестриктаза происходит от того же древнего корня, что и наш глагол «стричь»). Рестриктазы открыл швейцарец В. Арбер в 1970 г. Его дочь Анна потом рассказывала всем: «Мой папа открыл в клетках ножницы, которыми можно стричь ДНК».

В. Арбер работал в Цюрихе с фагами и нашел у них фермент, с помощью которого эти вирусы разрезают хозяйскую ДНК и вставляют в нее свой геном. Американец Х. Смит из университета им. Дж. Гопкинса в Балтиморе получил этот фермент в пробирке, а Д. Натанс стал его систематически применять, все трое получили за новый прорыв Нобелевскую премию в 1978 г.

С помощью рестриктаз и сшивающих ДНК ферментов операции на генах стали обычным делом. Не удивительно поэтому, что в 1973 г. у П. Берга из Стэнфорда созрела идея эксперимента по переносу ракового гена в кишечную палочку. Эта идея взволновала Поллака, который и позвонил Бергу, чтобы выразить свои сомнения в необходимости такого опасного эксперимента и его правомочности.

Дело в том, что ген ракового вируса СВ-40 предполагалось перенести с плазмидой в клетки кишечной палочки, которая обитает в кишечнике всех людей. Не заложим ли мы бомбу с часовым механизмом под все человечество, спрашивал Поллак. Где гарантия, что такая «переделанная» бактерия не вырвется из лабораторий и не заразит все человечество, породив вселенскую опасность неудержимой эпидемии рака?

Опасения были весьма оправданны. Тогда никто еще не знал, что такое гены раковых вирусов и какое отношение к генезу раковых опухолей у человека они имеют. Перенос гена в широко распространенную кишечную палочку действительно мог создать непредсказуемую опасность. Поллак вспоминал потом:

«Я поставил Берга в затруднительное положение, поскольку он честный человек и сразу не нашелся, что ответить. Под воздействием нашего разговора он отказался от задуманного эксперимента. Более того, вскоре он призвал и других ученых добровольно отказаться или воздержаться от, проведения подобных экспериментов с «рекомбинантными» ДНК до выяснения всех обстоятельств, связанных с обеспечением безопасности проводимых опытов...» (Рекомбинантными ДНК в то время называли ДНК, составленные из генов разных организмов, как бы скомбинированных, где часть ДНК взята, например, от вируса, а другая – от кишечной палочки.)

В июле 1974 г. группа Берга опубликовала в американском научном журнале «Сайенс» открытое письмо, призывающее биологов не проводить рискованных экспериментов, что может привести, помимо всего прочего, к появлению бактерий с повышенной устойчивостью к антибиотикам.

Рис. 4. Клетка кишечной палочки под электронным микроскопом (темная область – клеточная ДНК)

Письмо подписал и Дж. Уотсон, который тоже решил выступить против работ по «трансплантации генов». Но многие ученые были против подобного самоограничения. Одним из таких исследователей был учитель Уотсона С. Лурия, который писал:

«Как следует поступить? Самым нерациональным было бы выступать за мораторий в науке, чтобы помешать развитию пагубного метода. Но наука – подобно искусству – стала неотъемлемой частью свободы поиска. Подход ученых, произвольно приостанавливающих научные изыскания до тех пор, пока не решится вопрос об их социальных последствиях, может иметь отрицательные последствия для общества. Положительным можно было бы считать принятие учеными такой ответственности, которая убедительно доказала бы обществу, каковы могут быть последствия новейших научных открытий».

С целью привлечения всеобщего внимания к этой проблеме П. Берг организовал в Асиломаре на берегу Тихого океана неподалеку от Стэнфорда конференцию. На ней почти единогласно были приняты предложения оргкомитета, в состав которого входил Берг, призывающие проводить некоторые работы с рекомбинантными ДНК в специально оборудованных лабораториях, чтобы не распространять в окружающую среду биологическую опасность.

В дискуссию вступали и другие ученые, которые, казалось бы, были далеки от молекулярной генетики. Нобелевский лауреат Дж. Уолд, получивший свою награду за исследование механизмов зрения на молекулярном уровне, заявил, что новые опыты с бактериями могут умножить число генетических заболеваний.

Ему ответил М. Мезельсон, декан факультета биохимии Гарвардского университета, который в свое время первым экспериментально подтвердил одно из главных положений модели Уотсона и Крика – то, что ДНК двухцепочечна. В отличие от Уолда, Мезельсон всю свою сознательную научную жизнь занимался именно ДНК, поэтому для него эти рекомбинации, плазмиды, гены и полимеразы были хлебом насущным. Мезельсон заявил, что жизненно важное направление научных исследований, сулящее человечеству большие выгоды и избавление от многих бед, находится под угрозой срыва из-за преувеличенной боязни довольно слабо разбирающихся в этом людей.

В конечном итоге против этих страхов выступил и Дж. Уотсон, который заявил, что «слухи о преждевременной смерти и были несколько преувеличены», поэтому стоит оправиться от необоснованных опасений и продолжать спокойно работать. К тому же, как показала жизнь, остановить развитие науки действительно не дано никому. Пока П. Берг в Стэнфорде судил да рядил как быть, в другой лаборатории этого университета С. Коэн и его сотрудница А. Чанг осуществили-таки «конструирование в пробирке биологически функциональных молекул ДНК, которые комбинировали генетическую информацию из двух разных источников», как было потом сказано в американском журнале «Раковые исследования», и которые сейчас без подобного «комбинирования» и представить себе невозможно.

Они с помощью рестриктазы «разрезали» две плазмиды кишечной палочки, после чего внесли в нее гены от неродственного микроорганизма стафилококка, вызывающего нагноение, и... головастика африканской шпорцевой лягушки «ксенопус»! Примерно то же самое сделали Г. Бойер и Р. Хеллинг из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Еще через три года Г. Вармус и М. Бишоп из Массачусетского технологического института сумели «разрезать» геном вируса саркомы Роуса и выделить второй раковый ген СРК (затем последовала очередь ракового, или онкогена, из клеток карциномы человека). Онкология окончательно встала на молекулярные рельсы.

В 1973 г. советский исследователь А.Д. Альтштейн высказал идею о том, что онкогены имеют... клеточное происхождение, а вирусы только переносят их из клетки в клетку. Исследования, проведенные с ДНК, прекрасно подтвердили справедливость этой гипотезы. Оказалось, что в наших клетках имеются особые гены; которые кодируют необходимые для нормальной жизнедеятельности клетки белки. Но в. случае мутации эти гены переходят в онкогенное состояние, в результате чего синтезируемые по их «командам» белки начинают трансформировать клетки, становящиеся злокачественными. Так в отдельных случаях возникает рак.

В других случаях это может происходить по-иному. Забегая вперед, скажем, что в 1985 г. с помощью новейших методов биотехнологии были открыты так называемые гены-протекторы, которые защищают наши клетки от действия онкогенов. Сегодня один из таких генов уже выделен, идет интенсивная работа по расшифровке кодируемого им белка и выяснению его функции. При утере гена протектора клетка и весь организм остаются незащищенными от действия онкогенов и раковых белков. Возникает опухоль.

Выделение генов и создание способов их введения в клетки открыло перед биологами путь к началу современной биотехнологии, то есть технологии прямого манипулирования генами и их белковыми продуктами в промышленном масштабе. Благо, что промышленность, производящая биотехнологический продукт, уже работала. Что же это за промышленность, которая была создана загодя?

• «Для разгрома фашизма и освобождения Франции он сделал больше целых дивизий»

• Оглавление

Дата публикации:

14 ноября 2001 года